蛋白質(zhì)聚集和錯(cuò)誤折疊是蛋白質(zhì)治療劑生產(chǎn)中普遍存在的問題。細(xì)菌宿主是重組蛋白質(zhì)的高效表達(dá)系統(tǒng),但是細(xì)菌表達(dá)宿主內(nèi)蛋白質(zhì)產(chǎn)物的過表達(dá)常會(huì)產(chǎn)生大量聚集的、無活性的重組蛋白質(zhì)包涵體。其他利用哺乳動(dòng)物細(xì)胞、真菌或酵...[繼續(xù)閱讀]

    在從包涵體中復(fù)性蛋白質(zhì)之前,必須首先使聚集體和包涵體溶解和變性。增溶中最常用的變性劑為尿素和鹽酸胍。這兩種促溶劑均為小分子,易于結(jié)合蛋白質(zhì),進(jìn)而打破維持蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的分子內(nèi)和分子間作用力[5,6]。除尿素和鹽酸胍外...[繼續(xù)閱讀]

    當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)完全溶解后,將其轉(zhuǎn)移至另一熱力學(xué)上有利于天然構(gòu)象的溶液中來誘導(dǎo)復(fù)性。最常見的是通過降低促溶劑的濃度(采用稀釋或透析操作)至非變性水平來誘導(dǎo)蛋白質(zhì)復(fù)性。當(dāng)變性劑濃度下降至足夠低時(shí),氨基酸之間的分子內(nèi)作用...[繼續(xù)閱讀]

    伴隨著熱力學(xué)推動(dòng)的蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的折疊,二硫鍵也必須正確形成,才能獲得天然構(gòu)象的蛋白質(zhì)。盡管復(fù)性中形成正確二硫鍵的統(tǒng)計(jì)學(xué)概率比較低[10],但實(shí)際上通常可以以合理的效率形成天然二硫鍵。因此,我們推斷,蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的折...[繼續(xù)閱讀]

    蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性和溶解性與能否成功提高復(fù)性產(chǎn)率密切相關(guān)。如果天然蛋白質(zhì)在選擇的復(fù)性緩沖液中不能溶解,則復(fù)性不會(huì)發(fā)生。決定了使用何種能夠促進(jìn)溶解的復(fù)性緩沖液后,還需了解可改善天然蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性和溶解性的緩沖液配...[繼續(xù)閱讀]

    在開始蛋白質(zhì)復(fù)性之前,企業(yè)應(yīng)該考慮一個(gè)策略問題,即選擇從包涵體中復(fù)性蛋白質(zhì)還是考慮更換表達(dá)宿主生產(chǎn)正確折疊蛋白質(zhì)。細(xì)胞培養(yǎng)開發(fā)團(tuán)隊(duì)的特殊經(jīng)驗(yàn)可對(duì)這一決定加以指導(dǎo)。而且,哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的完全糖基化產(chǎn)物通常...[繼續(xù)閱讀]

    如果計(jì)劃開發(fā)復(fù)性過程,使用純化蛋白質(zhì)將對(duì)過程開發(fā)具有很大的指導(dǎo)作用。如果可以獲得純化蛋白質(zhì),我們建議同時(shí)建立其在尿素和鹽酸胍中的展開曲線。文獻(xiàn)中可找到幾篇有關(guān)建立和解釋展開曲線的良好的實(shí)用指南[16,17]。一般通...[繼續(xù)閱讀]

    二硫鍵的存在對(duì)復(fù)性過程的開發(fā)增加了一定程度的復(fù)雜性。前文曾經(jīng)提及,增溶階段二硫鍵必須被還原,而復(fù)性階段需被氧化。因此,對(duì)具有或沒有二硫鍵的蛋白質(zhì),我們提供不同的建議。4.3.3.1無二硫鍵蛋白質(zhì)的復(fù)性當(dāng)復(fù)性無二硫鍵的蛋...[繼續(xù)閱讀]

    測(cè)定復(fù)性是否成功的分析方法應(yīng)根據(jù)復(fù)性結(jié)果加以選擇。不可溶的聚集體可以通過光散射技術(shù)(～320nm波長(zhǎng)處紫外吸收或熒光散射)檢測(cè)。不可溶的產(chǎn)物也可以通過離心沉降,然后再次溶解并通過十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(S...[繼續(xù)閱讀]

    首次復(fù)性篩選完成后,可能會(huì)觀察到三個(gè)主要的結(jié)果:不可溶產(chǎn)物、可溶但錯(cuò)誤折疊產(chǎn)物和含有可測(cè)定天然蛋白質(zhì)的可溶性產(chǎn)物。根據(jù)首次復(fù)性篩選實(shí)驗(yàn)中獲得的是可溶性還是不可溶性產(chǎn)物,改善復(fù)性的后續(xù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)策略的重點(diǎn)有所不...[繼續(xù)閱讀]